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    Annexin V熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒實驗操作指南

    來源:Procell  瀏覽量:  發布時間:2019-09-29 09:49:55

    Procell自主研發的熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒用于鑒定凋亡和壞死細胞。

    Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白,與磷脂酰絲氨酸PS 有高度親和力,可通過細胞外側暴露的PS 與凋亡早期細胞胞膜結合,將Annexin V 標記上熒光染料利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡。

    由于凋亡晚期或壞死細胞膜完整性喪失,細胞核染色液可進入細胞內染色細胞核,搭配Annexin V 使用可將處于不同凋亡時期的細胞區分開。


        1.懸浮細胞:

    A.按照實驗方案進行凋亡誘導,300g離心5min,棄上清,收集細胞,用PBS洗滌細胞一次,輕輕重懸浮細胞并計數。

    B. 取1-5 × 105重懸的細胞,300g離心5min,棄上清。加入500μL稀釋成1 ×的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞。

    C. 細胞懸液中加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。

    D.輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育15-20min。

    E. 反應完成后立即上機檢測。如不能及時檢測,請于冰上避光靜置并于1小時內完成檢測。

    F. 檢測

    1)  流式細胞儀檢測

    處理好的樣本在流式細胞儀上檢測。

    2)  熒光顯微鏡分析

    取一滴用熒光素-Annexin V/細胞核染色液雙染的細胞懸液(E步驟處理過的細胞懸液)于載玻片上,并用蓋玻片蓋上細胞。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。


    2 貼壁細胞


    1)流式細胞儀檢測

    A.  按照實驗方案進行凋亡誘導,將培養基吸出轉移至干凈離心管內(待用),PBS清洗培養瓶細胞一次。

    B.  培養瓶中加入適量的胰酶消化細胞,室溫孵育至輕輕吹打可使貼壁細胞脫落,吸除胰酶消化液,避免胰酶消化過度。

    注意:對于貼壁細胞,胰酶消化步驟很關鍵。胰酶消化時間如果過短,細胞需要用力吹打才能脫落,容易造成細胞膜的損傷,從而導致細胞壞死的假陽性;消化時間如果過長,同樣易造成細胞膜損傷而出現細胞壞死的假陽性,甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-熒光素的結合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。同時,胰酶細胞消化液中應盡量不含EDTA,因為EDTA可能會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結合。

    C.  加入步驟A中收集的細胞培養液,將細胞輕輕吹打下來,轉移到離心管內,300g離心5min,棄上清,收集細胞,用PBS洗滌細胞一次,輕輕懸浮細胞并計數。

    注意:加入細胞培養液非常重要,一方面可以收集已經懸浮的發生凋亡或壞死的細胞,另一方面細胞培養液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶(殘留的胰酶會消化并降解后續加入的Annexin V-熒光素,導致染色失?。?。

    D.  取1-5× 105重懸的細胞,300g離心5min,棄上清。加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞。

    E.  細胞懸液中加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。

    F.  輕柔渦旋混勻后,室溫避光孵育15-20min。

    G.  反應完成后立即上機檢測。如不能及時檢測,請于冰上避光靜置并于1小時內完成檢測。

    H.  流式細胞儀檢測


    2)熒光顯微鏡原位檢測

    注:本方法優點是可以原位觀察細胞凋亡,缺點是部分凋亡由于貼壁不牢而檢測不到。

    A.  如果條件可以,在誘導凋亡后,用多孔板離心機300g離心5min。

    B.  吸除細胞培養液,用PBS洗滌兩次(如果條件允許,在此前做步驟A)。

    C.  離心后棄上清,加入500μL稀釋成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。

    D.  加入5μL的熒光素標記-Annexin V和5μL的細胞核染色液。

    E.  移液器輕輕混勻,室溫避光孵育15-20min。

    F.  Annexin V Binding Buffer工作液洗滌細胞一次

    G.  熒光顯微鏡檢測。在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。(如果無法觀察,可以在孔板下鋪上玻片使細胞貼附,最后取出用Annexin V Binding Buffer浸潤觀察)

    H.  反應完成后應立即觀察,取出貼附細胞玻片時,避免細胞干片。



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